Restriction Fragment Legnth Polymorphism (RFLP) dalam Konservasi Sumberdaya Perikanan

Ditulis Oleh

M. Nurul Fajri

1214111044

JURUSAN BUDIDAYA PERAIRAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS LAMPUNG

2014

I. PENDAHULUAN

 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) atau Polimorfisme Panjang Berkas Restriksi adalah suatu teknik untuk mengetahui perbedaan antar organisme dengan analisis pola yang berasal dari pembelahan DNA. Jika terdapat dua organisme yang berbeda dalam jarak antar bagian pembelahan restriksi endonuklease tertentu, panjang fragmen yang dihasilkan akan berbeda ketika DNA dicerna oleh enzim restriksi. Kesamaan pola yang dihasilkan dapat digunakan untuk membedakan spesies (bahkan strain) dari suatu organisme dengan organisme lainnya (Abuzenadah, 2009).

Polimorfisme adalah Suatu populasi spesies yang memiliki dua atau lebih ciri fenotip yang berbeda (Abuzenadah,2009). Banyak contoh polimorfisme dalam suatu populasi spesies, misalnya: berdasarkan hasil penelitian Dijkstra dan koleganya (2009), terdapat ikan berwarna merah dan biru pada ikan Cichlid (famili Cichlidae) di danau Victoria, gradasi warna yang dimiliki ikan juga bermacam-macam, ada yang mixed color dan ada yang solid color. Adanya polimorfisme akan menunjukkan tingkat keragaman genetik dalam populasi suatu spesies.

RFLP dapat digunakan dalam berbagai pengaturan yang berbeda untuk mencapai tujuan yang berbeda. Menurut Abuzenadah (2009) serta Dudu dan koleganya (2010), RFLP dapat diaplikasikan dalam hal-hal berikut:

1. RFLP dapat digunakan dalam kasus paternitas atau kasus kriminal untuk menentukan sumber sampel DNA, biasanya dalam hal forensik.

2. RFLP dapat digunakan untuk menentukan status penyakit dari suatu individu.

3. RFLP dapat digunakan untuk mengukur tingkat rekombinasi yang dapat mengarah kepada peta genetik dengan jarak antara lokus RFLP, diukur dalam centiMorgans (cM: unit yang digunakan untuk mengukur tingkat hubungan genetik).

II. ISI

2.1.Enzim Restriksi Endonuklease

Enzim restriksi endonuklease adalah enzim yang dapat memotong molekul DNA pada urutan nukleotida tertentu. Enzim biasanya mengenali 4 sampai 6 pasang basa. Umumnya, semakin pendek sekuens pengenalan, semakin besar jumlah fragmen yang dihasilkan. Jika molekul berbeda dalam sekuen nukleotida, dapat dihasilkan fragmen dengan ukuran yang berbeda. Fragmen-fragmen tersebut dapat dipisahkan dengan gel elektroforesis. Enzim restriksi dapat diisolasi dari berbagai jenis bakteri dan diperkirakan berada pada bagian dari sistem pertahanan sel terhadap virus yang menyerang bakteri. Enzim ini diberi nama dengan menggunakan huruf pertama dari genus, dua huruf pertama dari spesies, dan ordo (Abuzenadah, 2009).

2.2. PCR-RFLP

Teknik berbasis DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies ikan. Keuntungan dari teknik tersebut tidak hanya karena kemampuannya untuk mengidentifikasi spesies ikan  terkait, tetapi juga kemampuannya yang dapat dengan mudah mengidentifikasi beberapa spesies dalam suatu produk (Hisar dan koleganya, 2006). Di antara beberapa teknik yang berbasis DNA, RFLP menggabungkan aspek kesederhanaan, kecepatan, resolving power, dan biaya rendah dalam penggunaannya, serta merupakan pendekatan yang menarik untuk identifikasi spesies ikan (Wolf dan koleganya, 2000). Namun, teknik RFLP memiliki kelemahan, salah satunya yaitu RFLP membutuhkan banyak strain DNA. Penggabungan RFLP dengan PCR akan mempermudah proses dan membantu menghemat waktu (Abuzenadah, 2009).

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik untuk mengamplifikasi wilayah tertentu dari DNA yang didefinisikan oleh satu set dari dua "primer" di mana sintesis DNA dimulai oleh enzim DNA polimerase (Abuzenadah, 2009). PCR dapat digunakan untuk menggandakan sekuen tertentu dari DNA hingga berkali-kali lipat. Proses ini dapat meningkatkan bagian tertentu dari sekuen DNA hingga hingga berjumlah jutaan. Produk dari PCR dapat di deteksi oleh gel elektroforesis. Daerah amplifikasi biasanya ada di antara 150-3000 pasangan basa (Wolf dan koleganya, 2000). Berdasarkan Abuzenadah (2009), siklus PCR meliputi:

1.    Denaturation: Proses ini dilakukan pada suhu 95^oC dalam 30 detik. Pada saat denaturasi rantai ganda DNA mengalami pemisahan, sehingga media berisi rantai tunggal DNA yang disebut DNA template.

2.    Annealing: Proses ini dilakukan pada suhu 60^oC dalam 30 detik. Pada saat Annealing, digunakan molekul-molekul rantai asam nukleat yang akan mengawali proses PCR yang disebut sebagai Primer. Primer dideasin secara khusus agar bisa berkomplemen dengan DNA template.

3.    Extension: Proses ini dapat berlangsung pada suhu 60^oC, namun dapat dipercepat pada suhu 72^oC. Waktu berlangsungnya proses ini tergantung pada panjang pendeknya rantai DNA yang akan di amplifikasi.

Mengisolasi DNA hingga jumlahnya cukup untuk analisis RFLP akan sangat memakan waktu dan tenaga. Namun, PCR dapat mengamplifikasi DNA yang jumlahnya sedikit menjadi sangat banyak. Dengan teknik PCR, biasanya cukup 2 – 3 jam, kebutuhan DNA untuk analisis RFLP dapat terpenuhi. Proses analisis RFLP dengan bantuan PCR biasa disebut PCR- RFLP (Garret dan John, 2005).

2.3. Contoh Penggunaan RFLP dalam DNA Typing

Berikut ini adalah langkah-langkah penggunaan RFLP dalam DNA Typing Menurut Abuzenadah (2009):

1.    Ekstraksi: Langkah pertama dalam DNA typing adalah ekstraksi DNA dari sampel. Sampel bisa didapatkan dari darah, air liur, sperma atau beberapa zat biologis lainnya.

2.    Produksi Restriksi Fragmen: DNA yang dimurnikan kemudian dipotong menjadi fragmen-fragmen oleh enzim restriksi.

3.    Elektroforesis: Fragmen restriksi memiliki muatan negatif dan dapat dipisahkan dengan teknik yang disebut gel elektroforesis, yang akan memisahkan potongan DNA berdasarkan ukurannya. Sampel DNA yang telah diberi perlakuan enzim restriksi, ditempatkan di jalur terpisah pada lempengan gel elektroforesis yang ditempatkan pada medan listrik. Fragmen akan berpindah ke arah elektroda positif, fragmen yang lebih kecil bergerak lebih cepat daripada fragmen yang lebih besar, sehingga dapat memisahkan sampel DNA ke dalam band atau “pita” yang berbeda.

4.    Deteksi: Band-band tersebut dapat divisualisasikan menggunakan pewarna luminescent. Pendekatan untuk DNA Typing diperlukan sampel dalam jumlah cukup besar dari bahan biologisnya, hal ini bertujuan untuk mendapatkan hasil lebih baik dan data yang lebih masuk akal.

Gambar proses step by step RFLP (en.Wikipedia.org)

2.4. Peran RFLP dalam Konservasi Sumberdaya Perikanan

Peran utama dari analisis RFLP adalah untuk mengidentifikasi spesies organisme hingga ke tingkat molekuler (Anshary, 2011). Dalam hal konservasi sumberdaya perikanan, RFLP bisa digunakan untuk mengetahui keragaman genetik spesies-spesies ikan maupun organisme akuatik lainnya dalam sebuah populasi. Tingkat keanekaragaman genetik spesies harus diidentifikasi, hal ini penting untuk mengetahui apakah suatu populasi memiliki spesies yang beragam atau bahkan hanya satu atau beberapa spesies saja. Apabila dalam suatu populasi memiliki tingkat keragaman genetik yang rendah, hal ini akan merugikan baik bagi alam maupun bagi manusia. Ikan akan mudah menularkan penyakit pada ikan lain yang spesiesnya sama, hal tersebut tentu akan mempengaruhi perekonomian manusia, bahkan suatu negara. Oleh sebab itu, harus diketahui sedini mungkin untuk mencegah terjadinya hal tersebut, salah satu caranya  adalah dengan melakukan analisis RFLP (Dudu dan koleganya., 2010).

Selain itu, analisis RFLP juga dapat membantu mengidentifikasi organisme-organisme patogen penyebab penyakit pada ikan. Misalnya, RFLP bisa digunakan untuk mengetahui jenis-jenis parasit apa saja yang menyerang ikan tertentu. Contoh lain adalah RFLP dapat digunakan untuk mengetahui tingkat infeksi bakteri jenis X pada ikan tertentu. Ini akan sangat bermanfaat untuk mencegah atau meminimalisir terjadinya infeksi penyakit pada ikan, bahkan bisa menyelamatkan umat manusia dari penyakit akibat patogen yang bersifat zoonosis (Anshary, 2011).

DAFTAR PUSTAKA

Abuzenadah, Adel. 2009. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Saudi Arabia: Faculty of Applied Medical Sciences, King Abdul Aziz University.

Anshary, Hilal. 2011. Identifikasi Molekuler Dengan Teknik PCR-RFLP Larva Parasit Anisakis spp (Nematoda: Anisakidae) Pada Ikan Tongkol (Auxis thazard) Dan Kembung (Rastrelliger kanagurta) Dari Perairan Makassar. Jurnal Perikanan (J. Fish. Sci.), 8 (2): 70-77.

Dijkstra, Peter D., Charlotte Hemelrijk, Ole Seehausen, and Ton G.G. Groothuis. 2009. Color polymorphism and intrasexual competition in assemblages of cichlid fish. Behavioral Ecology Journal, 20 (1): 138-144.

Dudu, A., S. E. Georgescu, Anca Dinischiotu, Marieta Costache. 2010. PCR-RFLP Method to Identify Fish Species of Economic Importance. Archiva Zootechnica, 13 (1): 53-59

Garret, S., and John Dooley. 2005. Determination of PCR-RFLP Profiles for Fish Species Using the Agilent 2100 Bioanalyzer. Food Safety Journal, 1-7.

Hisar, O., Orhan Erdogan, Ercument Aksakal and Sukriye Aras Hisar. 2006. Authentication Of Fish Species Using A Simple PCR-RFLP Method. The Israeli Journal of Aquaculture – Bamidgeh 58 (1): 62-65.

Wolf, C., Martin Burgener, Philipp Hubner, and Jurg Luthy. 2000. PCR-RFLP Analysis of Mitochondrial DNA: Differentiation of Fish Species. LWT - Food Science and Technology, 33 (2): 144-150.